Les mégaphages abritent des protéines mini-Cas idéales pour l’édition de gènes

Les protéines de coupe d’ADN centrales à CRISPR-Cas9 et les outils d’édition de gènes associés provenaient à l’origine de bactéries, mais une nouvelle variété de protéines Cas a apparemment évolué dans des virus qui infectent les bactéries.

Les nouvelles protéines Cas ont été trouvées dans les plus grands virus infectieux bactériens connus, appelés bactériophages, et sont les variantes de Cas les plus compactes jamais découvertes – la moitié de la taille du cheval de bataille d’aujourd’hui, Cas9.

Les protéines Cas plus petites et plus compactes sont plus faciles à transporter dans les cellules pour effectuer la modification du génome, car elles peuvent être emballées dans de petits véhicules de livraison, y compris l’un des plus populaires: un virus désactivé appelé virus adéno-associé (AAV). Les protéines Cas Hypercompact laissent également de l’espace à l’intérieur de l’AAV pour un chargement supplémentaire.

En tant que l’une des plus petites protéines Cas connues à ce jour, la CasΦ (Cas-phi) nouvellement découverte présente des avantages par rapport aux outils actuels d’édition du génome lorsqu’elle doit être introduite dans les cellules pour manipuler les gènes des cultures ou guérir les maladies humaines.

« Les adénovirus sont le cheval de Troie parfait pour fournir des éditeurs de gènes: vous pouvez facilement programmer les virus pour qu’ils atteignent presque n’importe quelle partie du corps », a déclaré Patrick Pausch, stagiaire postdoctoral à l’Université de Californie à Berkeley et à l’Innovative Genomics Institute d’UC Berkeley. (IGI), un groupe de recherche conjoint UC Berkeley / UCSF consacré à la découverte et à l’étude de nouveaux outils pour l’édition de gènes dans l’agriculture et les maladies humaines. « Mais vous ne pouvez emballer qu’un très petit Cas9 dans un tel virus pour le livrer. Si vous aviez d’autres systèmes CRISPR-Cas qui sont vraiment compacts, par rapport à Cas9, cela vous donne suffisamment d’espace pour des éléments supplémentaires: différentes protéines fusionnées à la Protéine Cas, modèles de réparation de l’ADN ou autres facteurs qui régulent la protéine Cas et contrôlent le résultat de l’édition du gène. « 

Apparemment, ces «mégaphages» utilisent la protéine CasΦ – la lettre grecque Φ, ou phi, est utilisée comme raccourci pour les bactériophages – pour inciter les bactéries à combattre les virus rivaux, au lieu d’elle-même.

« Ce qui m’a réellement intéressé à étudier cette protéine en particulier, c’est que tous les systèmes CRISPR-Cas connus ont été initialement découverts dans des bactéries et des archées pour repousser les virus, mais c’était la seule fois où un type complètement nouveau de système CRISPR-Cas a été trouvé pour la première fois, et jusqu’à présent seulement, dans les génomes viraux « , a déclaré Basem Al-Shayeb, doctorant à l’IGI. « Cela nous a fait réfléchir à ce qui pourrait être différent au sujet de cette protéine, et avec cela est venu beaucoup de propriétés intéressantes que nous avons ensuite trouvées dans le laboratoire. »

Parmi ces propriétés: CasΦ a évolué pour être rationalisé, combinant plusieurs fonctions dans une protéine, de sorte qu’il peut se passer de la moitié des segments protéiques de Cas9. Il est aussi sélectif dans le ciblage de régions spécifiques de l’ADN que l’enzyme Cas9 d’origine bactérienne, et tout aussi efficace, et il fonctionne dans les cellules des bactéries, des animaux et des plantes, ce qui en fait un éditeur de gènes prometteur et largement applicable.

« Cette étude montre que cette protéine CRISPR-Cas codée par un virus est en fait très bonne dans ce qu’elle fait, mais elle est beaucoup plus petite, environ la moitié de la taille de Cas9 », a déclaré Jennifer Doudna, directrice exécutive de l’IGI, professeur de moléculaire à UC Berkeley. et la biologie cellulaire et de la chimie et un chercheur de Howard Hughes Medical Institute. « C’est important, car il pourrait être beaucoup plus facile de le livrer dans les cellules que ce que nous trouvons avec Cas9. Quand nous pensons à la façon dont CRISPR sera appliqué à l’avenir, c’est vraiment l’un des goulots d’étranglement les plus importants sur le terrain. en ce moment: livraison. Nous pensons que ce très petit système CRISPR-Cas encodé par un virus peut être un moyen de franchir cette barrière. « 

Pausch et Al-Shayeb sont les premiers auteurs d’un article décrivant CasΦ qui paraîtra cette semaine dans la revue Science.

Les biggiephages portent leurs propres protéines Cas

La protéine CasΦ a été découverte pour la première fois l’année dernière par Al-Shayeb dans le laboratoire de Jill Banfield, professeur de sciences terrestres et planétaires et de sciences de l’environnement, de politique et de gestion à l’Université de Berkeley. Les mégaphages contenant CasΦ faisaient partie d’un groupe qu’ils ont surnommé Biggiephage et ont été trouvés dans une variété d’environnements, des bassins vernaux et des sols forestiers saturés d’eau aux lagunes de fumier de vache.

« Nous utilisons le séquençage métagénomique pour découvrir les bactéries, les archées et les virus dans de nombreux environnements différents, puis nous explorons leurs inventaires de gènes pour comprendre comment les organismes fonctionnent indépendamment et en combinaison au sein de leurs communautés », a déclaré Banfield. « Les systèmes CRISPR-Cas sur phage sont un aspect particulièrement intéressant de l’interaction entre les virus et leurs hôtes. »

Alors que la métagénomique a permis aux chercheurs d’isoler le gène codant pour CasΦ, sa séquence leur a seulement indiqué qu’il s’agissait d’une protéine Cas de la famille Type V, bien qu’évolutivement éloignée des autres protéines Cas Type V, telles que Cas12a, CasX (Cas12e) et Cas14 . Ils n’avaient aucune idée s’il fonctionnait comme système immunitaire contre l’ADN étranger. L’étude actuelle a montré que, comme Cas9, CasΦ cible et clive les génomes étrangers dans les cellules bactériennes, ainsi que l’ADN double brin dans les cellules rénales embryonnaires humaines et les cellules de la plante Arabidopsis thaliana. Il peut également cibler une gamme de séquences d’ADN plus large que Cas9.

La capacité de CasΦ à couper l’ADN double brin est un gros plus. Toutes les autres protéines Cas compactes coupent préférentiellement l’ADN simple brin. Ainsi, bien qu’ils puissent s’intégrer parfaitement dans des systèmes de livraison compacts comme l’AAV, ils sont beaucoup moins utiles lors de l’édition d’ADN, qui est double brin, à l’intérieur des cellules.

Comme cela a été le cas après la reconnaissance des prouesses d’édition de gènes de Cas9 en 2012, il y a beaucoup de place pour optimiser CasΦ pour l’édition de gènes et découvrir les meilleures règles pour concevoir des ARN guides pour cibler des gènes spécifiques, a déclaré Pausch.