Advanced Cryo-EM révèle une structure complexe de réplication d’ARN viral dans des détails époustouflants

Pour la première fois, des scientifiques du Morgridge Institute for Research ont généré des images à résolution presque atomique d’un complexe majeur de protéines virales responsable de la réplication du génome d’ARN d’un membre des virus à ARN à brin positif, la grande classe de virus qui comprend les coronavirus et de nombreux autres agents pathogènes.

Les résultats devraient aider au développement de nouveaux types d’antiviraux et fournir des informations mécanistes sur le cycle de vie du virus.

«La capacité à visualiser ces structures cruciales évolue rapidement», déclare Paul Ahlquist, directeur du John W. and Jeanne M. Rowe Center for Virology Research au Morgridge Institute et professeur d’oncologie et de virologie moléculaire à l’Université du Wisconsin. -Madison. D’autres auteurs de l’étude comprenaient Nuruddin Unchwaniwala, Hong Zhan, Janice Pennington, Mark Horswill et Johan den Boon.

En utilisant une technique avancée appelée tomographie au microscope cryoélectronique (cryo-EM), Ahlquist et son équipe se sont appuyés sur leurs travaux antérieurs, qui ont d’abord révélé l’existence de ce complexe de réplication d’ARN viral en forme de couronne.

La nouvelle recherche, publiée le 20 juillet dans le Actes de l’Académie nationale des sciences (PNAS), montre le complexe couronne de réplication à une résolution considérablement améliorée d’environ 8,5 angstrôms, ce qui correspond à l’espacement de quelques atomes.

« Cryo-EM a récemment fait un bond en avant dans ses capacités », déclare Ahlquist. « Dans cette étude, notre groupe de recherche a combiné plusieurs avancées pour améliorer considérablement la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et le traitement d’images, et pour cartographier la position de domaines protéiques spécifiques dans le complexe. »

Les virus à ARN à brin positif abordés dans ce travail sont la plus grande des six classes génétiques de virus et comprennent de nombreux agents pathogènes importants tels que les virus Zika, dengue et chikungunya, ainsi que des coronavirus comme le SRAS-CoV-2, cause du COVID actuel. -19 pandémie.

Dans chaque virus à ARN à brin positif, la plupart des gènes viraux sont consacrés à un seul processus: la réplication du génome de l’ARN viral.

«Compte tenu de cet investissement massif de ressources, la réplication du génome de l’ARN viral est sans doute l’un des processus les plus importants de l’infection, et c’est déjà une cible majeure pour le contrôle des virus», déclare Ahlquist.

Au sein d’une cellule infectée, la réplication de l’ARN viral se produit au niveau des membranes cellulaires modifiées, souvent en association avec des sphérules, des vésicules induites par le virus d’une taille d’environ 50 à 100 nanomètres. Ahlquist et son équipe ont précédemment montré que dans chacun de ces complexes de réplication du génome, une copie du génome ou du chromosome de l’ARN viral est protégée à l’intérieur de la vésicule sphérique pour fonctionner comme un modèle de réplication. Le complexe de réplication copie à plusieurs reprises ce chromosome d’ARN viral d’archives pour produire de nouveaux génomes de descendance qui sont libérés par un col membraneux sur la vésicule dans le cytoplasme, où ils sont incorporés comme charge utile de nouveaux virions infectieux.

Ces travaux antérieurs ont en outre montré que la protéine virale clé qui induit les vésicules de réplication et copie l’ARN viral réside dans un anneau ou une structure de couronne frappant qui se trouve au sommet du côté cytoplasmique du col de la sphère qui se connecte au cytoplasme.

Les nouvelles images cryo-EM de plus haute résolution et les résultats complémentaires montrent que la couronne est composée de douze copies de la protéine clé de réplication de l’ARN viral disposées comme des portées dans un baril. De plus, les images ont révélé des interactions de type fermeture à glissière qui agissent comme des cerceaux sur un baril pour joindre les segments adjacents ensemble pour former la couronne en forme d’anneau. Ces interactions de fermeture éclair correspondent bien aux interactions multimérisantes que le groupe Ahlquist a précédemment cartographiées dans cette protéine.

La protéine de réplication de l’ARN viral qui forme la couronne est une protéine multifonctionnelle extrêmement volumineuse, multi-domaines, d’une taille de près de 1000 acides aminés. Cette protéine contient de l’ARN polymérase et des domaines de coiffage d’ARN – deux domaines enzymatiques qui sont conservés dans de nombreux virus à ARN à brin positif pour synthétiser de nouvelles copies du génome viral – ainsi que d’autres domaines pour la multimérisation, la liaison des membranes et d’autres fonctions.

La manière dont ces domaines sont physiquement organisés dans la structure de la couronne est l’un des problèmes les plus importants pour comprendre le fonctionnement du complexe de réplication et a été l’une des nombreuses motivations fortes pour définir la structure de la couronne à haute résolution.

En utilisant une approche combinant une étiquette spécifique au site génétiquement modifiée avec un marquage par des particules d’or à l’échelle nanométrique visibles dans la cryo-EM, les chercheurs ont découvert que l’extrémité de la polymérase C-terminale de la protéine de réplication de l’ARN viral est positionnée à l’apex de la couronne, laissant le domaine de coiffage N-terminal au bas de la structure pour interagir avec la membrane.

Cette position apicale de la polymérase a des implications mécaniques importantes pour les premières étapes du processus de réplication qui recrutent le modèle d’ARN viral de départ dans le complexe et forment la vésicule de réplication, ainsi que pour les étapes ultérieures dans lesquelles le modèle est copié pour faire de nouveaux génomes de descendance à emballer dans des particules virales infectieuses. Ces résultats fournissent une base solide pour d’autres expériences visant à définir la structure et la fonction du complexe de réplication à des niveaux encore plus élevés.

«Nous espérons continuer à améliorer la structure de la couronne du complexe de réplication de l’ARN afin d’apporter d’autres améliorations importantes à l’avenir», déclare Ahlquist. « Nous espérons également répondre aux indications croissantes de nos travaux selon lesquelles les changements conformationnels de ces protéines sont essentiels à leurs multiples fonctions. »

«De telles avancées révéleront de plus en plus en détail comment ces complexes s’assemblent et fonctionnent, et donc comment les attaquer au mieux», ajoute-t-il. « Ces informations devraient fournir la base de mécanismes antiviraux nouveaux et plus puissants. »