Une nouvelle compréhension de l’outil CRISPR-Cas9 pourrait améliorer l’édition de gènes

Une nouvelle compréhension de l'outil CRISPR-Cas9 pourrait améliorer l'édition de gènes

Une nouvelle compréhension de l'outil CRISPR-Cas9 pourrait améliorer l'édition de gènes

La structure 3D d’un éditeur de base, composé de la protéine Cas9 (blanche et grise), qui se lie à une cible ADN (bleu sarcelle et hélice bleue) complémentaire du guide ARN (violet), et des protéines désaminase (rouge et rose), qui commutent un nucléotide pour un autre. Crédit: UC Berkeley image par Gavin Knott et Audrone Lapinaite

En à peine huit ans, CRISPR-Cas9 est devenu l’éditeur de génome incontournable pour la recherche fondamentale et la thérapie génique. Mais CRISPR-Cas9 a également engendré d’autres outils de manipulation de l’ADN potentiellement puissants qui pourraient aider à corriger les mutations génétiques responsables de maladies héréditaires.


Des chercheurs de l’Université de Californie à Berkeley ont maintenant obtenu la première structure 3D de l’un des plus prometteurs de ces outils: les éditeurs de bases, qui se lient à l’ADN et, au lieu de couper, remplacent précisément un nucléotide par un autre.

Créés pour la première fois il y a quatre ans, les éditeurs de bases sont déjà utilisés pour tenter de corriger des mutations mononucléotidiques dans le génome humain. Les éditeurs de base maintenant disponibles pourraient traiter environ 60% de toutes les maladies génétiques connues – potentiellement plus de 15 000 maladies héréditaires – causées par une mutation dans un seul nucléotide.

La structure détaillée en 3-D, rapportée dans le numéro du 31 juillet de la revue Science, fournit une feuille de route pour peaufiner les éditeurs de base afin de les rendre plus polyvalents et contrôlables pour une utilisation chez les patients.

« Nous avons pu observer pour la première fois un éditeur de base en action », a déclaré Gavin Knott, postdoctoral à l’UC Berkeley. « Désormais, nous pouvons comprendre non seulement quand cela fonctionne et quand cela ne fonctionne pas, mais aussi concevoir la prochaine génération d’éditeurs de base pour les rendre encore meilleurs et plus appropriés cliniquement. »

Un éditeur de base est un type de protéine de fusion Cas9 qui utilise une Cas9 partiellement désactivée (ses cisailles de capture sont désactivées de sorte qu’elle ne coupe qu’un seul brin d’ADN) et une enzyme qui, par exemple, active ou fait taire un gène, ou modifie les zones adjacentes d’ADN. Étant donné que la nouvelle étude rapporte la première structure d’une protéine de fusion Cas9, elle pourrait aider à guider l’invention d’une myriade d’autres outils d’édition de gènes basés sur Cas9.

«Nous voyons en fait pour la première fois que les éditeurs de base se comportent comme deux modules indépendants: vous avez le module Cas9 qui vous donne de la spécificité, puis vous avez un module catalytique qui vous fournit l’activité», a déclaré Audrone Lapinaite, une ancienne UC Berkeley stagiaire postdoctoral qui est maintenant professeur adjoint à l’Arizona State University à Tempe. « Les structures que nous avons obtenues de cet éditeur de base lié à sa cible nous donnent vraiment un moyen de penser aux protéines de fusion Cas9, en général, nous donnant des idées quelle région de Cas9 est la plus bénéfique pour fusionner d’autres protéines. »

Lapinaite et Knott, qui ont récemment accepté un poste de chercheur à l’Université Monash en Australie, sont les co-premiers auteurs de l’article.

Structure Cryo-EM de l’éditeur de base (ABE8e) dans l’acte d’édition d’ADN. Crédit: Gavin J. Knott (ID PDB: 6VPC)

Modifier une base à la fois

En 2012, les chercheurs ont d’abord montré comment réorganiser une enzyme bactérienne, Cas9, et en faire un outil d’édition de gènes dans tous les types de cellules, de la bactérie à l’humain. L’idée originale de Jennifer Doudna, biochimiste à l’UC Berkeley, et de sa collègue française, Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 a transformé la recherche biologique et introduit la thérapie génique dans la clinique pour la première fois depuis des décennies.

Les scientifiques ont rapidement coopté Cas9 pour produire une multitude d’autres outils. Fondamentalement, un mélange de protéines et d’ARN, Cas9 cible précisément un segment d’ADN spécifique, puis le coupe avec précision, comme une paire de ciseaux. Cependant, la fonction des ciseaux peut être interrompue, ce qui permet à Cas9 de cibler et de lier l’ADN sans couper. De cette façon, Cas9 peut transporter différentes enzymes vers des régions ciblées de l’ADN, permettant aux enzymes de manipuler les gènes.

En 2016, David Liu de l’Université de Harvard a combiné un Cas9 avec une autre protéine bactérienne pour permettre le remplacement chirurgicalement précis d’un nucléotide par un autre: le premier éditeur de base.

Alors que le premier éditeur de base d’adénine était lent, la dernière version, appelée ABE8e, est incroyablement rapide: elle complète près de 100% des modifications de base prévues en 15 minutes. Pourtant, ABE8e peut être plus enclin à modifier des morceaux d’ADN non intentionnels dans un tube à essai, créant potentiellement ce que l’on appelle des effets hors cible.

La structure nouvellement révélée a été obtenue avec une technique d’imagerie de haute puissance appelée cryo-microscopie électronique (cryoEM). Les tests d’activité ont montré pourquoi ABE8e est susceptible de créer plus de modifications hors cible: la protéine désaminase fusionnée à Cas9 est toujours active. Lorsque Cas9 saute autour du noyau, il se lie et libère des centaines ou des milliers de segments d’ADN avant de trouver sa cible. La désaminase attachée, comme un canon lâche, n’attend pas une correspondance parfaite et modifie souvent une base avant que Cas9 ne se repose sur sa cible finale.

Savoir comment le domaine effecteur et Cas9 sont liés peut conduire à une refonte qui rend l’enzyme active uniquement lorsque Cas9 a trouvé sa cible.

«Si vous voulez vraiment concevoir une protéine de fusion vraiment spécifique, vous devez trouver un moyen de faire en sorte que le domaine catalytique fasse plus partie de Cas9, de sorte qu’il détecte quand Cas9 est sur la bonne cible et alors seulement s’activer, au lieu d’être actif tout le temps », a déclaré Lapinaite.

La structure d’ABE8e met également en évidence deux changements spécifiques dans la protéine désaminase qui la font fonctionner plus rapidement que la première version de l’éditeur de base, ABE7.10. Ces deux mutations ponctuelles permettent à la protéine de saisir l’ADN plus étroitement et de remplacer plus efficacement A par G.

« En tant que biologiste structurel, je veux vraiment regarder une molécule et réfléchir à des moyens de l’améliorer rationnellement. Cette structure et la biochimie qui l’accompagne nous donnent vraiment ce pouvoir », a ajouté Knott. «Nous pouvons maintenant faire des prédictions rationnelles sur la façon dont ce système se comportera dans une cellule, car nous pouvons le voir et prédire comment il va se casser ou prédire des moyens de l’améliorer.


Édition de gène CRISPR plus sûre avec moins de hits hors cible


Plus d’information:
A. Lapinaite el al., «DNA capture by a CRISPR-Cas9 – guidenine base editor», Science (2020). science.sciencemag.org/cgi/doi… 1126 / science.abb1390

Fourni par University of California – Berkeley

Citation: Une nouvelle compréhension de l’outil CRISPR-Cas9 pourrait améliorer l’édition des gènes (30 juillet 2020) récupéré le 31 juillet 2020 sur https://phys.org/news/2020-07-crispr-cas9-tool-gene.html

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